Ayasofya Doğu Roma İmparatorluğu’nun İstanbul’da yapmış olduğu en büyük kilise olup aynı yerde üç kez inşa edilmiştir. İlk yapıldığında Megale Ekklesia (Büyük Kilise) olarak adlandırılmış, 5. yüzyıldan itibaren ise Ayasofya (Kutsal Bilgelik) olarak tanımlanmıştır. Ayasofya Doğu Roma İmparatorluğu boyunca hükümdarların taç giydiği, başkentin en büyük kilisesi olarak katedral işlevi görmüştür.

Günümüz Ayasofya’sı İmparator Justinianos (527-565) tarafından dönemin iki önemli mimarı olan Miletos’lu (Milet) İsidoros ile Tralles’li (Aydın) Anthemios’a yaptırılmıştır. Tarihçi Prokopios’un aktardığına göre, 23 Şubat 532 yılında başlayan inşa, 5 yıl gibi kısa bir sürede tamamlanmış ve kilise 27 Aralık 537 yılında törenle ibadete açılmıştır. Kaynaklarda, Ayasofya’nın açılış günü İmparator Justinianos’un, mabedin içine girip, “Tanrım bana böyle bir ibadet yeri yapabilme fırsatı sağladığın için şükürler olsun” dedikten sonra, Kudüs’teki Hz. Süleyman Mabedi’ni kastederek “Ey Süleyman seni geçtim” diye bağırdığı geçer.

IV. Haçlı Seferi sırasında İstanbul Latinler tarafından 1204- 1261 yılları arasında işgal edilmiş, bu dönemde gerek kent, gerekse Ayasofya yağmalanmıştır. 1261 yılında Doğu Roma kenti tekrar ele geçirdiğinde, Ayasofya’nın oldukça harap durumda olduğu bilinmektedir.

Ayasofya, Fatih Sultan Mehmed’in (1451-1481) 1453’te İstanbul’u fethetmesiyle camiye çevrilmiştir. Fetihten hemen sonra yapı güçlendirilerek en iyi şekilde korunmuş ve Osmanlı Dönemi ilaveleri ile birlikte cami olarak varlığını sürdürmüştür. Yapıldığı tarihten itibaren çeşitli depremlerden zarar gören yapıya, hem Doğu Roma, hem de Osmanlı Döneminde destek amacıyla payandalar yapılmıştır. Mimar Sinan tarafından yapılan minareler ise aynı zamanda yapıda destekleyici payanda işlevi görmektedir.

Ayasofya’nın kuzeyine, Fatih Sultan Mehmed Dönemi’nde bir medrese yaptırılmış, her dönemde bakım ve onarım çalışmalarından geçmiş, en kapsamlı tamir çalışması Sultan Abdülmecid Dönemi'nde (1839-1861) Fossati tarafından  yapılmıştır. Sultan Abdülaziz Döneminde Ayasofya çevresinin yeniden düzenlenme çalışmaları sırasında medrese 1869- 1870 yılları arasında yıktırılmış ve1873- 1874 yılları arasında ise yeniden  yaptırılmıştır. 1936 yılında yıkılmış olan Medresenin kalıntıları 1982 yılında yapılan kazılar sonucu ortaya çıkarılmıştır.

Osmanlı Dönemi’nde, 16. ve 17. yüzyıllarda, Ayasofya’nın içine mihraplar, minber, müezzin mahfilleri, vaaz kürsüsü ve maksureler eklenmiştir.

Mihrabın iki yanında bulunan bronz kandiller, Kanuni Sultan Süleyman (1520-1566) tarafından Budin Seferi (1526) dönüşünde camiye hediye edilmiştir.

Ana mekâna girişin sağ ve sol köşelerinde bulunan Helenistik Döneme (MÖ. 4.-3. yy) ait iki mermer küp ise, Bergama’dan getirilerek, Sultan III. Murad (1574-1595) tarafından Ayasofya’ya hediye edilmiştir.

Ayasofya’da, Sultan Abdülmecid Dönemi’nde 1847-1849 yılları arasında, İsviçreli Fossati Kardeşlere kapsamlı bir onarım yaptırılmıştır. Bu onarım çalışmaları sırasında, daha önce mihrabın kuzeyindeki niş içinde bulunan Hünkâr Mahfili kaldırılmış, yerine mihrabın solunda, sütunlar üzerinde yükselen, etrafı ahşap yaldızlı korkuluklarla çevrili Hünkâr Mahfili yapılmıştır.

Aynı dönemde Hattat Kadıasker Mustafa İzzet Efendi tarafından yazılan 7.5 m. çapındaki 8 adet hat levhası ana mekânın duvarlarına yerleştirilmiştir. “Allah, Hz. Muhammed, Hz. Ebubekir, Hz. Ömer, Hz. Osman, Hz. Ali, Hz. Hasan ve Hz. Hüseyin” yazılı bu levhalar İslam âleminin en büyük hat levhaları olarak bilinmektedir. Aynı hattat kubbenin ortasına ise Nur Suresi’nin 35. ayetini yazmıştır.

Ayasofya Mustafa Kemal Atatürk’ün emri ve Bakanlar Kurulu kararı ile müzeye çevrilmiş ve 1 Şubat 1935’de müze olarak, yerli ve yabancı ziyaretçilere açılmıştır. 1936 tarihli tapu senedine göre, Ayasofya “57 pafta, 57 ada, 7. parselde Fatih Sultan Mehmed Vakfı adına Türbe, Akaret, Muvakkithane ve Medreseden oluşan Ayasofya-i Kebir Camii Şerifi” adına tapuludur.